La estructura compleja de partición puede surgir del deslizamiento y puenteo de dímeros ParB

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4567 (2023) Citar este artículo

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En muchas bacterias, la segregación cromosómica requiere la asociación de ParB a la región centromérica que contiene parS para formar el complejo de partición. Sin embargo, la estructura y formación de este complejo no están claras. Recientemente, estudios han revelado que la unión de CTP permite que los dímeros de ParB se deslicen a lo largo del ADN y condensen la región centromérica mediante la formación de puentes de ADN. Utilizando simulaciones de polímeros semiflexibles, demostramos que estas propiedades pueden explicar la formación de complejos de partición. Los puentes transitorios de ParB organizan el ADN en estados globulares o en horquillas y estructuras helicoidales, dependiendo de la vida útil del puente, mientras que simulaciones separadas muestran que el deslizamiento de ParB reproduce el perfil de unión de múltiples picos observado en Caulobacter crescentus. Combinando deslizamiento y formación de puentes en un modelo unificado, encontramos que los puentes ParB de corta duración no impiden el deslizamiento y pueden reproducir tanto el perfil de unión como la condensación del complejo de nucleoproteína. En general, nuestro modelo aclara el mecanismo de formación del complejo de partición y predice su estructura fina.

La segregación fiel de los cromosomas es esencial para la replicación eficiente de las células. Para ello, los cromosomas bacterianos y los plásmidos de bajo número de copias emplean sistemas de partición activa, siendo el sistema ParABS uno de los más extendidos1,2,3. Este sistema consta de tres componentes: secuencias parS de tipo centromérico y dos proteínas, ParB, que forma dímeros que se unen específicamente a la secuencia parS, y ParA, una ATPasa, cuya actividad es estimulada por ParB4,5.

ParB se propaga a varias kilobases de ADN que rodean los sitios parS, que en las bacterias se concentran cerca del origen de replicación6. Esta difusión es esencial para que estos sistemas funcionen, aunque el grado de difusión varía sustancialmente entre sistemas7,8,9,10,11,12,13. En cualquier caso, se cree que el resultado es un complejo de nucleoproteína, el complejo de partición, que es claramente visible mediante microscopía de fluorescencia. Originalmente se propuso que la propagación se debía a la formación de un filamento de nucleoproteína que se extendía desde el sitio parS7,8,14. Sin embargo, posteriormente se demostró que hay muy pocas proteínas ParB para formar estructuras tan grandes10. En cambio, se descubrió in vitro que ParB condensa el ADN mediante la unión no específica del ADN y la formación de puentes proteicos10,15,16,17,18,19.

Estos resultados motivaron estudios de modelado de la formación de complejos de partición. En particular, el modelo de expansión y puenteo propuso que el complejo de partición se forma a través de una combinación de puentes de largo alcance (3D) e interacciones de corto alcance (1D) con el vecino más cercano20. Sin embargo, posteriormente se argumentó que este modelo era incompatible con el perfil de unión de ParB del plásmido F11. En cambio, se propuso que el perfil observado se debe al enjaulamiento espacial de ParB alrededor del sitio de nucleación parS, debido a interacciones no específicas y transitorias, y a la naturaleza polimérica del ADN11,21,22. Este modelo también puede entenderse como el límite de dispersión débil del modelo de dispersión y puente23.

Recientemente, se ha demostrado que ParB exhibe actividad CTPasa dependiente de parS que es necesaria para la correcta formación y dinámica del complejo de partición13,24,25,26,27,28. Se demostró que los dímeros de ParB unidos a CTP se cargan y abarcan el ADN en los sitios parS y posteriormente se deslizan a lo largo de la cadena de ADN antes de disociarse finalmente. También se demostró in vitro que la unión de CTP permite que se produzcan puentes de ParB en concentraciones fisiológicas (mucho más bajas que las requeridas en ausencia de CTP10,15) y conduce a una condensación eficiente del ADN29,30. Estos resultados cambian fundamentalmente nuestra comprensión de cómo se forma el complejo de partición y sugieren que es necesario reevaluar los modelos anteriores. En particular, ningún estudio de modelado ha proporcionado todavía un marco unificado para el deslizamiento y la formación de puentes del dímero ParB. El deslizamiento de ParB también puede tener relevancia adicional para los sistemas cromosómicos ParABS, que normalmente tienen varios sitios parS genómicamente separados y, como resultado, más de un pico en el perfil de unión de ParB9,10,12,13,21,31,32,33. 34, pero tienen un único complejo de partición visible por origen en las células de tipo salvaje10,35.

Aquí, investigamos el papel del deslizamiento y la formación de puentes de ParB en la formación de complejos de partición utilizando simulaciones de reacción-difusión y polímeros semiflexibles. Primero mostramos que diferentes tiempos de vida de los puentes ParB conducen a conformaciones de polímeros claramente diferentes. Luego estudiamos el régimen de vida corta en el que se forman distintas estructuras de ADN (horquillas y hélices) y mostramos cómo estas estructuras dan como resultado la condensación del ADN recubierto de ParB. Luego utilizamos simulaciones estocásticas para mostrar que el deslizamiento de ParB puede reproducir la distribución de ParB de múltiples picos observada experimentalmente y explorar los efectos de los obstáculos en el deslizamiento. Finalmente, combinamos el puenteo y el deslizamiento de ParB en simulaciones de difusión de reacción/polímero acoplado fuera de equilibrio y mostramos que el puenteo no inhibe el deslizamiento de ParB para vidas útiles de puente suficientemente cortas. En general, nuestro trabajo respalda un nuevo modelo de formación de complejos de partición en el que los dímeros ParB se cargan en el ADN en los sitios parS antes de deslizarse de forma difusiva a lo largo del ADN. Los dímeros ParB, genómicamente distantes, pero espacialmente próximos, interactúan para formar puentes transitorios que organizan el ADN mediante la formación de estructuras en horquilla y helicoidales. Especulamos que estas estructuras facilitan la función adicional de ParB para cargar complejos de mantenimiento estructural de cromosomas (SMC) en el cromosoma.

Para obtener un modelo realista de formación de complejos de partición, utilizamos un modelo de polímero reticular semiflexible de la región centromérica de 10 kb de C. crescentus en el que cada monómero corresponde a 20 pb, la huella aproximada de un dímero ParB28,36 ( Figura 1a). El ADN se modela como una cadena lineal utilizando una implementación cinética del modelo de polímero BFM (Método de fluctuación de enlaces)37. Dado que el ADN es rígido a esta escala, introducimos un costo energético para doblarlo para obtener la longitud de persistencia medida experimentalmente de lp ~ 120 pb (Figura complementaria 1a) 38. El BFM es muy adecuado para esto, ya que permite un gran conjunto de ángulos de unión37 y, por lo tanto, puede implementar la rigidez de manera más realista que los modelos que solo permiten ángulos de unión de 0∘ o 90∘. La distancia de la red corresponde a 2,2 nm. Los movimientos de monómero permitidos se intentan a una velocidad p, que define la escala de tiempo polimérica fundamental τ = 1/p y se aceptan de acuerdo con el costo de energía correspondiente.

a Esquema del modelo de polímero. Se pueden formar puentes entre monómeros espacialmente proximales y genómicamente distantes a una velocidad proporcional a la ocupación de ParB en cada monómero. La distribución ParB se muestra explícitamente en c. b Paisaje energético de una interacción puente-sin puente entre dos monómeros espacialmente cercanos i y j. Hay un cambio general en la energía ΔEij al realizar el puente. Se muestra la relación entre las energías de activación para el puente (\({{\Delta }}{E}_{ij}^{b}\)) y el puente (ΔEub) y las velocidades de reacción utilizadas en el modelo. Bi es la ocupación de ParB en el monómero i y p es la tasa de intentos de movimiento polimérico que define la escala de tiempo polimérica τ = 1/p. c El perfil ParB ChIP-Seq normalizado12 especifica la distribución de ParB. Los sitios parS están representados por puntos rojos. Tenga en cuenta que los dos sitios parS están muy juntos. d Diagrama de fases del sistema en términos de la constante de enlace efectiva \(\frac{{k}_{b}}{{k}_{ub}}{B}^{2}=\left\langle \exp ( {{\Delta }}{E}_{ij}/{k}_{B}T)\right\rangle\), donde B2 se define como la media \(\left\langle {B}_{i} {B}_{j}\right\rangle\) tomado todo i, j con ∣i−j∣>1, y \(\frac{p}{{k}_{ub}}=\exp ({ {\Delta }}{E}^{ub}/{k}_{B}T)\), la vida útil relativa del puente (ver Métodos). e El radio ponderado ParB medio para vidas útiles de puentes cortas y largas (±SD) (indicado por las líneas discontinuas en d) en función del número de puentes. Datos de 1000 conformaciones para cada conjunto de parámetros. Los círculos indican las ubicaciones respectivas de f, g y h, i. f Un ejemplo de conformación del polímero en estado globular. g Mapa de contacto promedio en la misma ubicación basado en 1000 conformaciones. Un contacto se define como dos monómeros que se encuentran dentro de cinco sitios de red uno del otro. h Un ejemplo de conformación del polímero en estado estructurado. i Mapa de contacto promedio en la misma ubicación, en caso contrario como en g. Las ubicaciones estudiadas en f, g y h, i tienen un promedio de ~85 puentes. En la figura complementaria 1f, g se muestran gráficos equivalentes para el régimen tipo bobina, indicado por el círculo más a la izquierda en d. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El polímero está limitado por la formación de puentes entre monómeros inducidos por ParB. Esto se implementa permitiendo que dos monómeros del polímero no vecinos, espacialmente próximos, formen un puente a una velocidad que depende de sus ocupaciones de ParB Bi, Bj y un parámetro de velocidad kb. Cada dímero/monómero solo puede unir otro dímero/monómero a la vez (en lo sucesivo, "dímero" siempre se referirá a un dímero ParB y "monómero" a un monómero del polímero de ADN simulado). Los puentes se disocian aleatoriamente de la tasa kub y, por lo tanto, tienen vidas útiles distribuidas exponencialmente. Estas tasas están relacionadas con las energías de activación para unir y desenredar, cuya diferencia, ΔEij es la energía de enlace asociada de la interacción (Fig. 1b). Más detalles del modelo se encuentran en la sección Métodos.

Dado que los dímeros de ParB pueden deslizarse a lo largo del ADN, la propagación de ParB por toda la región centromérica puede ocurrir, al menos en principio, independientemente de cualquier estructura 3D. Por lo tanto, inicialmente modelamos implícitamente los dímeros de ParB, utilizando la probabilidad relativa de ocupación de ParB, obtenida del perfil de unión experimental (ChIP-Seq), para especificar la probabilidad de que se forme un puente cuando dos monómeros dados se acercan. Esto nos permitirá investigar primero cómo la distribución genómica de ParB observada puede, a través de puentes, afectar la estructura de la región centromérica, independientemente de la cuestión de la propagación de ParB. Examinaremos el acoplamiento entre los dos procesos de deslizamiento y puente más adelante.

El perfil de unión de ParB de múltiples picos de C. crescentus consta de tres picos claros centrados en cinco sitios parS (tenga en cuenta que dos de estos sitios parS solo están separados por 42 pb y, por lo tanto, normalmente no se distinguen en nuestras figuras) (Fig. 1c). . Si bien se han identificado otros dos supuestos sitios parS12, no están asociados con un enriquecimiento significativo de ParB. Este perfil se utiliza en nuestro modelo de polímero para especificar las ocupaciones del dímero ParB Bi a lo largo del polímero y, por lo tanto, hasta un parámetro general kb, la tasa de puenteo entre pares de monómeros proximales. Al simular el sistema, encontramos un resultado sorprendente: el puente inducido por ParB conduce a dos fases distintas para el complejo de partición. Las vidas útiles de los puentes prolongadas hacen que el polímero colapse en una estructura similar a un glóbulo (Fig. 1f), mientras que en vidas útiles de puentes más cortas, el polímero está más estructurado con regiones de puentes localizadas y extendidas (Fig. 1h). Tenga en cuenta que "largo" y "corto" son relativos a la escala de tiempo polimérica τ. Dado que no tenemos una estimación experimental de esta escala de tiempo en la escala de longitud (20 pb) considerada aquí, no podemos proporcionar valores específicos.

El efecto también fue evidente en los mapas que muestran la ubicación de los puentes ParB (Figuras complementarias 1b, d). Mientras que los mapas de puentes de las conformaciones estructuradas muestran líneas distintivas de ±45∘, los del régimen globular muestran una distribución más aleatoria. Sin embargo, a pesar de las claras diferencias en sus conformaciones, ambos regímenes exhiben mapas de puentes muy similares a nivel de población (Figura complementaria 1c, e), que muestran un patrón de tablero de ajedrez centrado en los sitios parS y no tienen líneas de ± 45∘ detectables. . Tal patrón es consistente con una preferencia general por contactos dentro y entre regiones asociadas con picos en el perfil de unión de ParB. También se observó un patrón similar en los mapas de probabilidad de contacto (Fig. 1g, i), aunque el régimen globular tuvo más contactos para el mismo número de puentes, como se esperaba por su mayor nivel de compactación. Esto resalta cómo la visión promedio de la población sobre la organización del ADN puede no ser informativa sobre la estructura de las conformaciones individuales.

Para caracterizar mejor estos diferentes regímenes, construimos el diagrama de fases del sistema (Fig. 1d). Se podrían identificar tres regiones: un régimen libre similar a una bobina en el que hay muy pocos puentes (menos de 20, un valor elegido mediante inspección) y el comportamiento del polímero está dictado simplemente por su rigidez y exclusión de volumen (Figura complementaria 1f, g), y los regímenes estructurado y globular (no estructurado). Definimos la transición entre los regímenes estructurado y globular utilizando el radio ponderado de ParB, es decir, el radio de la distribución espacial de ParB debido a la conformación del polímero (ver Métodos). El estado globular tiene un radio ponderado de ParB mucho más pequeño en comparación con el estado estructurado con el mismo número de puentes ParB (Fig. 1e). Este radio se estabiliza a medida que el sistema se adentra más en el régimen globular. Por lo tanto, elegimos un umbral de 55 nm para distinguir los dos regímenes en función de dos desviaciones estándar por encima del valor medio estabilizado (Fig. 1e).

Proponemos que estos dos regímenes surgen debido al grado de movimiento que realiza el polímero entre eventos de puente. El puente puede ser limitado cinéticamente (limitado por las velocidades intrínsecas de puenteo/despuente) o limitado por difusión (la proximidad de los monómeros es el factor limitante y la cinética es tan rápida que la rotura y la formación del puente se correlacionan porque los puentes recién rotos tienden a recombinarse antes). el polímero puede explorar el espacio conformacional)39. Considere una conformación de polímero puenteada (Figura complementaria 1h). En la región de difusión limitada, la recombinación aumenta efectivamente la vida útil del puente (la energía de activación de la desconexión)40,41. Esto fortalece un efecto cooperativo en el que es más probable que se formen nuevos puentes cerca de un puente existente porque los monómeros adyacentes también tienen una mayor probabilidad de estar o acercarse y el tiempo necesario para que se forme un nuevo puente es mucho menor. que la vida útil (prolongada) del puente. La repetición de este proceso conduce a las regiones extendidas de los puentes que observamos (Figura complementaria 1h). El coste conformacional de los puentes también se reduce al tener puentes agrupados. Anteriormente se había observado un efecto similar en simulaciones de la proteína puente H-NS42. Por otro lado, en puentes con vidas útiles largas, los eventos de formación de puentes son cinéticamente limitados y el polímero es capaz de reorganizar y explorar el espacio conformacional entre los eventos de formación de puentes. Como resultado, hay muchos más eventos de puentes potenciales (monómeros que se acercan) lejos de los puentes existentes que en el régimen de difusión limitada de vida corta. Esto da como resultado más puentes y una distribución más aleatoria de los puentes (Figura complementaria 1b) y, por lo tanto, una configuración de polímero globular (Figura complementaria 1h). El aumento en el número de puentes supera el costo conformacional adicional de tener los puentes dispersos en lugar de localizados como en el régimen estructurado.

Dado que el régimen globular recuerda a propuestas anteriores de organización compleja de partición11,20,21, a continuación nos centraremos en examinar el estado estructurado. Volveremos al estado globular en el último apartado.

El régimen estructurado que se encuentra en las vidas cortas de los puentes ParB se define por la presencia de dos estructuras distintas, horquillas y hélices. Las horquillas se forman cuando el polímero se dobla 180∘ sobre sí mismo para formar puentes entre segmentos antiparalelos, mientras que en las hélices, el polímero gira 360∘ completos con puentes entre segmentos paralelos (Fig. 2a). Estas dos estructuras son visualmente diferentes pero también tienen diferentes patrones de puentes subyacentes, lo que permite identificarlas claramente en los mapas de puentes. Las horquillas corresponden a líneas +45∘, mientras que las hélices corresponden a líneas −45∘. La ubicación de la línea con respecto a la diagonal principal indica la longitud del bucle de la horquilla o el período de la hélice. Como era de esperar, estas estructuras generalmente se forman cerca de los sitios de parS. Sin embargo, observamos una variación sustancial: la punta de una horquilla (indicada por donde la línea 45∘ en el mapa del puente cruza la diagonal principal) a menudo estaba razonablemente lejos del sitio parS más cercano (Fig. 2a). En niveles más bajos de puentes, estas estructuras se forman con mayor frecuencia dentro de la región cubierta por el pico central que contiene tres sitios parS.

a Estructuras de ejemplo con mapas de puentes correspondientes (los mapas de puentes se han ampliado para que las líneas sean más claras) para horquillas y hélices con un promedio de 30 puentes. Las conformaciones completas del polímero y los mapas de puentes se pueden ver en la figura complementaria 2a. Los puntos rojos indican los sitios parS. Tenga en cuenta que como dos de los sitios sólo están separados por 42 pb, no siempre son distinguibles. b Número medio de horquillas y hélices por conformación. El sombreado representa el SEM. c Mapa de contacto promedio para el polímero en un promedio de 30 puentes de vida corta. d Volumen medio ocupado por el polímero y radio medio ponderado ParB. El sombreado representa la SD. La línea de puntos a 78 nm muestra el radio ParB determinado experimentalmente para C. crescentus. e Densidad de ParB tridimensional de complejos de partición con un promedio de 30 puentes que muestran un radio de 78 nm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Utilizamos las líneas distintivas de ± 45 ∘ para cuantificar la aparición de horquillas y hélices en función del grado de puenteo en el sistema (Fig. 2b). Encontramos que la frecuencia de ambas estructuras aumentó aproximadamente linealmente con el número de puentes, siendo las horquillas las más comunes. De ~ 30 puentes, cada conformación contenía al menos una estructura (Figura complementaria 2b). En los niveles más altos de puentes estudiados (~100 puentes), cada conformación contenía de 3 a 4 estructuras, que podían ser de cualquier tipo e involucrar sitios de parS múltiples y distantes. Sin embargo, las diferentes estructuras constituyentes aún podían identificarse a partir de las líneas ±45∘ en los mapas del puente. Sin embargo, como se analizó en la sección anterior, las líneas de ± 45 ∘ no son evidentes en el mapa de contacto promedio del conjunto o en el mapa de puentes que muestra un patrón a cuadros centrado en los sitios parS (Fig. 2c y Fig. 2c complementaria).

De acuerdo con los experimentos in vitro, el puente ParB condujo a la condensación del polímero de ADN. Tanto el volumen ocupado (ver Métodos de definición) como el radio de giro al cuadrado disminuyeron con el número de puentes (Fig. 2d, Fig. complementaria 2d). In vivo, el complejo de nucleoproteína se visualiza a través de la distribución espacial de una variante de ParB marcada con fluorescencia, que forma focos distintos dentro de las células. Para conectar con estas observaciones, combinamos la distribución genómica de ParB en el ADN (basado en el perfil ChIP-seq), con nuestras conformaciones simuladas del polímero de ADN para obtener la distribución espacial resultante de ParB unido al ADN (Fig. 2e). . La densidad esférica resultante recordaba a la observada experimentalmente mediante microscopía de molécula única. Se ha medido experimentalmente utilizando microscopía PALM de súper resolución que el radio del complejo de partición de C. crescentus es de ~78 nm35. Esto podría lograrse en nuestras simulaciones con sólo 30 puentes ParB. Esto corresponde a una disminución del 20% en comparación con el valor en ausencia de puentes (Fig. 2d).

En las secciones anteriores, ignoramos la cuestión de cómo se forma la distribución genómica de ParB, sino que nos centramos en cómo la distribución observada puede afectar, a través de puentes, la organización y compactación de la región centromérica. En esta sección, hacemos lo contrario y consideramos cómo se propaga ParB a lo largo del ADN, ignorando cualquier efecto potencial del puente de ParB. Varios estudios in vitro recientes han demostrado que los dímeros ParB de los sistemas cromosómicos ParABS (C. crescentus, Myxococcus xanthus y Bacillus subtilis) pueden atrapar el ADN en parS antes de deslizarse en cualquier dirección de forma similar a una pinza de ADN13,24,25,26 ,27,28,30. Se cree que la disociación se debe principalmente a la hidrólisis del CTP. Recientemente desarrollamos un modelo estocástico de este mecanismo de propagación en el contexto de M. xanthus13 y descubrimos que la carga en los sitios parS, la difusión 1D a lo largo del ADN y la disociación fueron capaces de reproducir cualitativamente el perfil de unión de ParB observado en ChIP-Seq. El coeficiente de difusión 1D previsto también coincidió con las mediciones de microscopía de molécula única. Sin embargo, el perfil de unión de M. xanthus es relativamente ruidoso y consiste en gran medida en un único pico centrado en un grupo de todos menos uno de sus 24 sitios parS. Por lo tanto, el perfil de picos múltiples y menos ruidoso de C. crescentus puede servir como una mejor prueba de la relevancia in vivo del modelo de carga y deslizamiento. Si bien se encuentran disponibles otros perfiles de unión de ParB con múltiples picos21,32,33,34, la afinidad de unión de cada sitio parS de C. crescentus se ha determinado de modo que la carga de ParB en el modelo se pueda describir usando un solo parámetro en lugar de uno para cada sitio parS.

Utilizamos el mismo modelo fundamental que anteriormente13, modificado para C. crescentus. Los dímeros ParB se cargan en el ADN, modelado como una red 1D, en cualquiera de los cinco sitios parS. Luego, los dímeros cargados se difunden a lo largo de la red con un coeficiente de difusión efectivo D y se disocian aleatoriamente a una velocidad koff (Fig. 3a). Estudios experimentales anteriores han demostrado que al cargar en los sitios parS, los dímeros ParB forman una abrazadera de proteína que abarca completamente y posteriormente se desliza a lo largo de la cadena de ADN13,24,25,26,27,28. En consonancia con esto, se ha demostrado que los dímeros de ParB no pueden superar los obstáculos unidos al ADN25,27. Tenga en cuenta que debido al atrapamiento relativamente estrecho de la cadena de ADN, asumimos en nuestro modelo que los dímeros deslizantes de ParB actúan como obstáculos entre sí (basándonos en las estructuras, no se espera que un dímero pueda pasar a través del bucle de otro13,25). 26). Los sitios parS también deben estar libres para que se cargue un dímero. El número total de dímeros de ParB se fija en el valor medido de 36035, y los dímeros libres se tratan como una población masiva (citosólica) bien mezclada. La tasa de carga relativa en cada sitio se especifica por su afinidad relativa por ParB12, dejando una única tasa de carga general kon.

a Diagrama que representa el modelo deslizante, que muestra los dímeros de ParB que se unen en un sitio parS, se difunden a lo largo de la red y se desvinculan. b Imágenes representativas de la recuperación de fluorescencia después del experimento de fotoblanqueo (FRAP). Se fotoblanqueó un único foco de eGFP-ParB (flecha) en una celda que contenía dos focos. La barra de escala es de 1 μm. Todas las imágenes de lapso de tiempo para esta celda se pueden ver en la figura complementaria 3a. c Análisis de datos FRAP. La intensidad relativa promedio del complejo de partición blanqueado (azul) y sin blanquear (verde) se muestra en función del tiempo (n = 51 células). Las líneas discontinuas representan el comportamiento de un modelo ajustado, que encontró un tiempo medio de 64 s (ver Métodos). El sombreado representa la SD. d Simulación del deslizamiento de ParB en comparación con los datos de ChIP-seq de la ref. 12, ambos normalizados por altura máxima. El área sombreada indica la parte del perfil ChIP-seq que se ajustó a una exponencial para encontrar el coeficiente de difusión efectivo. e Simulaciones de deslizamiento de ParB con un tiempo de residencia de 1 s para diferentes ocupaciones de barricadas. La barricada está indicada por el punto amarillo. Higos similares. Los tiempos de residencia para 10 y 100 segundos se encuentran en la figura complementaria 3d. f Igual que en e pero para 75% de ocupación con una vida útil de control variable. Tanto en e como en f, la línea de puntos muestra el perfil cuando no hay ningún obstáculo. g Diagrama de fases que muestra la diferencia entre simulaciones con y sin obstáculo. El color indica la relación entre el área de distribución a la derecha del control de carretera y el área total en el lado derecho del sitio parS. Las ubicaciones del control de carreteras y el sitio parS se muestran en e o f. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Primero determinamos el coeficiente de difusión efectivo D y la tasa de disociación koff. Para estimar esto último, realizamos la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) de focos de eGFP-ParB en células predivisionales que contienen dos focos (complejos de partición) (Fig. 3b). Después de blanquear uno de los dos focos, la señal de fluorescencia se recuperó con un tiempo medio de 64 s (Fig. 3c, Fig. Suplementaria 3a, b). Esto proporciona una estimación de la tasa de disociación koff (ver Métodos). Curiosamente, se han medido tiempos de recuperación de ParB aproximadamente similares para M. xanthus13 y el plásmido F21,43.

Para determinar el coeficiente de difusión, ajustamos la parte exterior del tercer pico a un ex/λ exponencial con \(\lambda=\sqrt{\frac{D}{{k}_{{{{{{{{\rm {off}}}}}}}}}}\) (Fig. 3d), la distribución continua prevista bajo este modelo para un sitio parS aislado (ver Métodos). El valor ajustado de λ = 710 pb da entonces D = 5600 pb2 s−1 = 6,1 × 10−4 μm2 s−1. Esto es más bajo que los coeficientes de difusión informados anteriormente para proteínas que se difunden a lo largo del ADN bacteriano44, incluidas mediciones previas de ParB13,43, que son del orden de 10-2 μm2 s-1. Veremos a continuación que se requiere un valor mayor en el modelo acoplado para superar el efecto de obstáculo de los puentes.

Queda por determinar un parámetro del modelo: la tasa de carga general de ParB kon. Mediciones anteriores han estimado que ~80 % (290) de los dímeros de ParB en la célula están en focos de ParB35. Por el contrario, encontramos que incluso a altas tasas de carga, <220 dímeros de ParB están asociados con el ADN (Figura complementaria 3c). Aumentar aún más kon no aumenta sustancialmente el número de ParB vinculados, ya que los sitios parS están ocupados casi continuamente. La disparidad en el número de dímeros asociados al ADN puede deberse a varios factores. En primer lugar, el número máximo posible de dímeros asociados en nuestras simulaciones depende de la discretización elegida, ya que cada sitio/monómero de la red puede estar unido por un único dímero ParB. Por lo tanto, si la huella de ParB es menor que nuestro tamaño de discretización de 20 pb, estaríamos subestimando la ocupación alcanzable de ParB. En segundo lugar, la estimación in vivo de la concentración celular de ParB se basa en la transferencia Western cuantitativa, que tiene un margen de error sustancial45. Los focos ParB también pueden contener una población citosólica o unida no específicamente que no se tiene en cuenta en nuestro modelo.

Dado lo anterior, elegimos la tasa de carga para nuestro modelo encontrando el mejor ajuste de las simulaciones a los datos de ChIP-seq (Figura complementaria 3c), obteniendo kon = 200 ⋅ koff. Esto da como resultado una concordancia notablemente buena entre el modelo y el perfil ChIP-Seq (Fig. 3d), lo que indica que la carga y el deslizamiento difuso de los dímeros ParB pueden explicar el perfil de unión observado. También sugiere que los dímeros no se ven afectados en gran medida por la transcripción y otros procesos que podrían obstaculizar la propagación de ParB, ya que no hemos tenido en cuenta estos efectos en nuestro modelo. Este puede no ser el caso de otros sistemas como el plásmido F que muestra cambios en el perfil de unión coincidentes con los promotores21,46. De hecho, experimentos in vitro han demostrado que las proteínas de unión al ADN de alta afinidad, como EcoRI (con la mutación E11Q catalíticamente inactiva) y TetR, pueden bloquear el deslizamiento de los dímeros ParB a lo largo del ADN25,27,30.

Para comprender mejor cómo los obstáculos pueden afectar la propagación de los dímeros ParB, utilizamos nuestra simulación deslizante para examinar el efecto en la propagación desde un solo sitio parS. Representativo de la situación biológica, no consideramos un obstáculo permanente sino más bien dinámico, que especificamos en términos de su vida media y ocupación, es decir, la fracción total de tiempo que el obstáculo está unido al ADN. Estas dos medidas son independientes entre sí, por ejemplo, una barricada que está presente y ausente durante 1 segundo a la vez tiene el mismo 50 % de ocupación que una barricada presente y ausente durante 10 segundos a la vez. Descubrimos que con una vida útil de 1 s, la barricada tuvo un efecto sorprendentemente leve en la propagación, y solo se hizo perceptible a partir de una ocupación de ~75%. Incluso con una ocupación del 95%, aproximadamente la mitad del número de dímeros se deslizan más allá del sitio del control de carretera que en su ausencia (Fig. 3e). De manera similar, con una ocupación del 75%, solo se observó un efecto negativo en la propagación durante la vida útil de los controles de carretera <~1 s (Fig. 3f).

Podemos entender estos resultados de la siguiente manera. Cuando el obstáculo está presente durante un tiempo mucho más corto que el intervalo de tiempo entre los intentos de cruce de dímeros, entonces no se desarrolla una acumulación de dímeros. Incluso durante tiempos más prolongados, la acumulación de dímeros se puede eliminar si hay suficiente tiempo entre eventos de barricadas, es decir, si la ocupación promedio de las barricadas es suficientemente baja (Fig. 3g). Estos resultados pueden explicar por qué no observamos una desviación significativa del perfil de unión de ParB con respecto al esperado de nuestro modelo simple de carga y deslizamiento: la ocupación in vivo y los tiempos de residencia de las proteínas que se unen a la región centromérica de C. crescentus pueden simplemente no ser lo suficientemente grandes. afectar sustancialmente la difusión de ParB.

A continuación, investigamos si los puentes de ParB son compatibles con el perfil de unión de ParB, es decir, ¿la formación espontánea de puentes de ParB entre dímeros de ParB espacialmente próximos pero genómicamente distantes limitaría la propagación general de ParB y produciría un perfil de unión fundamentalmente diferente? Para responder a esta pregunta, combinamos nuestras simulaciones de polímero y deslizamiento (Fig. 4a). A diferencia de las simulaciones anteriores, la unión de monómeros proximales ahora depende explícitamente de la presencia de un dímero ParB en cada sitio en lugar de una distribución ParB preespecificada. Tenga en cuenta que, dado que el deslizamiento de ParB es un proceso de no equilibrio, este modelo acoplado está necesariamente fuera de equilibrio. Suponemos que los dímeros puenteados no pueden deslizarse a lo largo del ADN debido al atrapamiento de regiones genómicamente distantes, por lo que actúan como obstáculos para los dímeros deslizantes no puenteados. Las simulaciones se ejecutan hasta el estado estacionario y se registran las distribuciones de ParB y las conformaciones del polímero.

a Representación de simulaciones de polímeros acoplados en las que combinamos puentes y deslizamientos. b Perfil de ParB generado a partir de simulaciones de deslizamiento y puentes con una vida útil del puente de 1 segundo en comparación con los datos de ChIP-seq de un estudio anterior12, ambos normalizados por la altura máxima. c Ejemplos de estructuras en horquilla y helicoidales encontradas en simulaciones acopladas, con un promedio de 25 puentes. Las conformaciones completas y los mapas de puentes individuales se pueden encontrar en la figura complementaria 4a. d Mapa de contacto promedio para simulaciones acopladas (arriba a la derecha) y simulaciones desacopladas (abajo a la izquierda) con un radio de ~78 nm. Cada mapa de contactos está elaborado a partir de 1000 simulaciones. e Promedio tridimensional del complejo de partición ParB para 25 puentes con un radio de 78 nm. f Diagrama que muestra la adición de ParB-ParB en el reclutamiento cis al modelo acoplado. g Perfil de ParB a lo largo del polímero con reclutamiento adicional de ParB-ParB, las áreas donde el perfil es sustancialmente diferente a los datos de ChIP-seq se resaltan en rojo. Para todos los gráficos mostrados, las simulaciones están en el régimen estructurado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los mismos valores determinados en la sección anterior se utilizan para la carga del dímero ParB (kon = 200 ⋅ koff) y la disociación (\({k}_{off}=\frac{\log (2)}{64}{{{{ {{{{\rm{s}}}}}}}}}^{-1}\)). Actualmente no hay estimaciones sobre la vida útil del puente. Esperamos que los puentes tengan una vida útil significativamente más corta que la de los dímeros ParB en el ADN y, por lo tanto, se elige un valor nominal de kub = 1 s-1. Con un valor demasiado alto (del orden de la vida útil de ParB en el ADN), los dímeros deslizantes de ParB no tendrían tiempo de superar los obstáculos (puentes de ParB) antes de desvincularse. Accedemos a los dos regímenes comentados en el primer apartado a través de la movilidad del polímero. Elegimos arbitrariamente dos valores de p para representar los regímenes estructurados y de tipo glóbulo (basados ​​en el barrido del modelo de puente simple). Esto deja el coeficiente de difusión por deslizamiento y la tasa de puenteo general como parámetros libres. Estos se eligen de manera que podamos reproducir tanto un radio ParB de 78 nm como la distribución genómica esperada. No podemos utilizar el valor encontrado para el coeficiente de difusión en la sección anterior debido a la introducción de puentes ParB, lo que hace que los dímeros ParB se deslicen una distancia más corta creando picos más nítidos. Por lo tanto, este valor debe ajustarse en función del número de puentes ParB-ParB. Para el régimen estructurado que se analiza a continuación, se utiliza un valor de 4,4 × 10−3 μm2 s−1 para resolver el perfil ChIP-seq para 25 puentes. Este es un límite inferior. Los valores más grandes tienen muy poco efecto en el perfil de ParB recuperado a medida que los dímeros deslizantes de ParB alcanzan el equilibrio entre los eventos de puente. Este límite inferior está dentro de un orden de magnitud del coeficiente de difusión de ParB medido in vivo13,43.

Para el régimen estructurado, encontramos que las simulaciones acopladas podrían reproducir el perfil de unión medido por ChIP-seq (Fig. 4b), con un ajuste aún mejor que el que obtuvimos de la simulación de deslizamiento no polimérico (Fig. 3d). Es importante destacar que también observamos las mismas estructuras helicoidales y de horquilla que en las simulaciones de polímeros desacoplados que tenían el perfil de unión ParB dado como entrada (Fig. 4c) y obtuvimos mapas de contacto promedio (Fig. 4d) y de puente muy similares (Fig. 4b). Estas estructuras nuevamente compactan el polímero y pudimos alcanzar el radio medido de 78 nm (Fig. 4e).

En el régimen globular pudimos reproducir ampliamente el perfil ChIP-seq, aunque las simulaciones no pudieron capturar con precisión la profundidad de los valles (Figura complementaria 4c). Se encontraron mapas de contactos y puentes similares (Figura complementaria 4d, e). Curiosamente, el complejo de partición está menos condensado en las simulaciones acopladas que en las simulaciones desacopladas con el mismo número medio de puentes, mientras que no se detectó ninguna diferencia significativa para el régimen estructurado (Figura complementaria 4f, g).

Estudios in vitro recientes han demostrado que los dímeros ParB de B. subtilis cargados con ADN pueden cargar dímeros adicionales independientemente de parS ('reclutamiento ParB-ParB')47, lo que podría explicar la unión cooperativa no específica del ADN observada previamente15,18,19 y consistente. con interacciones entre dímeros a través de sus dominios N-terminales16,48. Para explorar si dicho reclutamiento podría ser relevante in vivo, agregamos el reclutamiento cis ParB-ParB a nuestro modelo (Fig. 4f). Aunque los mismos autores también demostraron el reclutamiento de personas trans, esto sería sustancialmente más desafiante y computacionalmente más intensivo de implementar.

Descubrimos que incluso una tasa de reclutamiento de ParB-ParB relativamente baja, para la cual el número total de dímeros unidos aumentó en menos del 20%, da como resultado un perfil de unión fundamentalmente diferente. La propagación de ParB aumentó mediante la aparición de "hombros" que se descomponen lentamente en los extremos de la distribución. Como resultado, la caída exponencial distintiva observada en el perfil experimental ChIP-seq ya no se reproduce (Fig. 4g) y esto no se pudo remediar cambiando los parámetros del modelo. Este resultado sugiere que el reclutamiento de ParB-ParB no juega un papel significativo in vivo en la propagación de ParB, lo que coincide con el hallazgo de Tišma et al. que el reclutamiento de ParB-ParB representa solo el 10% de los eventos de carga de ParB in vitro47.

El modelo de deslizamiento y puenteo presentado aquí utiliza descubrimientos recientes para investigar la formación y estructura del complejo de partición. Estudios recientes in vitro han demostrado que, dependiendo de CTP, ParB puede cargarse en el ADN en los sitios parS antes de deslizarse aleatoriamente a lo largo de la cadena13,24,25,26,27,28. También se demostró que ParB puede condensar ADN de manera eficiente, nuevamente en presencia de CTP, mediante la formación de puentes entre regiones de ADN genómicamente distantes10,15,29,30. Si bien no hemos modelado explícitamente la naturaleza dependiente de CTP de estos procesos, nuestro modelo es consistente con la hidrólisis de CTP que desencadena la desvinculación de los dímeros de ParB y, por lo tanto, establece la escala de longitud del deslizamiento13,25. Nuestro modelo predice que el deslizamiento dinámico y la formación de puentes de ParB dan como resultado dos regímenes conformacionales diferentes, uno globular y otro estructurado para vidas de puentes largas y cortas, respectivamente. Este último régimen depende de la rigidez del ADN. Si esto se ignora, dominan los puentes de corto alcance entre monómeros vecinos y no se desarrollan estructuras de ADN. Esto es consistente con los resultados de estudios previos sobre la organización de la cromatina49,50 que no incorporan rigidez y con puentes formados por moléculas mucho más grandes42. También mostramos cómo la distribución genómica de ParB podría definir su distribución espacial mediante la formación de puentes de ParB. Luego modelamos explícitamente tanto el deslizamiento de ParB a lo largo del ADN como la formación de puentes de ADN ParB-ParB. Es importante destacar que encontramos que los puentes de vida suficientemente corta no obstaculizan el deslizamiento de ParB a lo largo del ADN y nuestro modelo podría reproducir tanto la distribución genómica como espacial medida de C. crescentus ParB.

Especulamos que los dos regímenes diferentes podrían tener relevancia en diferentes contextos biológicos. Las horquillas y hélices del régimen estructurado pueden facilitar la carga de complejos SMC (mantenimiento estructural de los cromosomas) en el ADN51. Si bien se sabe que esto se debe a ParB en los sitios parS52, el mecanismo preciso es un tema de estudio en curso53,54. Sin embargo, también se sabe que las mutaciones de ParB que eliminan el reclutamiento de SMC reducen la capacidad de ParB para formar un complejo de nucleoproteínas de orden superior53,55,56. Esto nos lleva a postular que las estructuras de ADN inducidas por ParB que observamos son relevantes para la carga de complejos SMC (Fig. 5). Además, los sistemas cromosómicos ParABS a menudo tienen múltiples sitios parS separados6 que producen un perfil de unión de múltiples picos9,10,12,13,21,31,32,33,34, mientras que un solo grupo de sitios parS parece ser más común para los plásmidos. -sistemas basados57. Los sitios parS separados permitirían la formación de múltiples horquillas y, por lo tanto, podrían ser beneficiosos para la carga de SMC.

Caricatura de la estructura del complejo tabique. Los dímeros ParB se cargan en los sitios parS y luego se deslizan a lo largo del ADN donde pueden interactuar con dímeros espacialmente proximales y genómicamente distantes para formar puentes ParB-ParB. Estos puentes pueden organizar el ADN en estructuras helicoidales y en horquilla. Las estructuras en horquilla podrían estar potencialmente involucradas en el reclutamiento de SMC en el ADN.

Por el contrario, los plásmidos portadores de ParABS, especialmente los de E. coli y otras bacterias que no portan SMC58, probablemente no requerirían estas estructuras. En lugar de ello, puede resultar ventajoso formar un complejo de partición más compacto para facilitar mejor la función de partición de ParABS. De hecho, mientras que el plásmido F ParB se extiende sobre una región cuatro veces más grande que el ParB de C. crescentus11, el complejo de partición resultante es significativamente más pequeño (un radio (2σ) de 35 nm)43. Por lo tanto, especulamos que los sistemas ParABS basados ​​​​en plásmidos pueden operar en la región globular más compacta.

El cromosoma bacteriano está, en promedio, superenrollado negativamente59. Esto da como resultado la formación de bucles superenrollados (plectonemas) que dividen el cromosoma en dominios de ~10 kb topológicamente aislados60. Sin embargo, los experimentos y simulaciones de ADN in vitro también han detectado plectonemas simples en el rango bajo de kilobases61,62,63. Por lo tanto, estas estructuras, que son topológicamente similares a las horquillas, pueden ser relevantes en la escala de 1 a 2 kb de los picos de la distribución ParB. Esperamos que solo promuevan la formación de puentes debido al contacto de las cadenas de ADN (las hélices probablemente sean menos relevantes ya que están termodinámicamente desfavorecidas en comparación con los plectonemas64). De hecho, un modelo anterior de formación del complejo de partición del plásmido F argumentaba que se requiere superenrollamiento para explicar la compacidad observada del complejo de partición de ese sistema22.

Las conformaciones que observamos en nuestras simulaciones son similares a las observadas recientemente usando microscopía de fuerza atómica para B. subtilis ParB30, pero se requiere un estudio más detallado para probar nuestra predicción de estructuras en horquilla. Nuestro modelo también podría caracterizarse mejor mediante el conocimiento de la vida útil del puente ParB-ParB, que podría lograrse in vitro mediante el uso de pinzas magnéticas para probar el tiempo de relajación del ADN condensado con ParB tras la eliminación de ParB del tampón. La caracterización in vivo del complejo de partición es más desafiante. Si bien nuestros mapas de contacto simulados son, en principio, comparables a los mapas de contacto experimentales producidos por captura de conformación de cromatina (HiC), la resolución de esta técnica aún no es suficiente para sondear la estructura del ADN en la escala de longitud corta de la región centromérica de C. crescentus. Esto puede cambiar a medida que la técnica mejore65,66.

En general, hemos presentado un modelo físico para la formación del complejo de particiones del sistema ParABS. Nuestro modelo dinámico de deslizamiento y puentes concilia el resultado reciente de que ParB se propaga a lo largo del ADN deslizándose como una abrazadera de ADN con la capacidad de ParB de condensar la región centromérica en un complejo de nucleoproteína. El trabajo experimental futuro ayudará a evaluar el modelo y probar sus predicciones.

Simulamos el ADN de la región centromérica utilizando el modelo de fluctuación de enlaces (BFM)37, un modelo de polímero reticular que reproduce la dinámica del polímero de Rouse. Específicamente, el ADN se modela como una cadena lineal en una red cúbica tridimensional con condiciones de contorno reflectantes. Cada monómero ocupa un sitio cúbico de la red, incluidos los ocho puntos de la red asociados. Además, cada punto de la red sólo puede estar ocupado por un monómero a la vez para dar cuenta del volumen excluido de la cadena. Los monómeros individuales están conectados mediante vectores de enlace tomados de un conjunto de 108 vectores permitidos. Este conjunto se elige de manera que la cadena polimérica no pueda atravesarse a sí misma37. Los monómeros pueden mover un sitio de red a la vez en cada dirección cartesiana sujeto a la restricción de los vectores de enlace permitidos y el volumen excluido. El modelo es ergódico en el sentido de que el espacio de configuración del polímero se puede muestrear utilizando únicamente movimientos locales. Utilizamos una implementación cinética, basada en el método de Gillespie67, ya que esto nos permite incorporar la dinámica del puente (ver más abajo).

Consideramos que cada monómero representa 20 pb, ya que esta es la huella aproximada de un dímero ParB y conduce a simulaciones computacionalmente manejables. En C. crescentus, ParB se extiende sobre una región de ~ 10 kb del cromosoma y, por lo tanto, simulamos un polímero con una longitud correspondiente de 500 monómeros.

Para tener en cuenta la rigidez del ADN, seguimos el enfoque de Zhang et al.68 e introducimos un potencial de flexión E de coseno cuadrado entre enlaces sucesivos.

donde θ es el cambio de ángulo entre enlaces sucesivos y ks es un parámetro que controla la rigidez. Tenga en cuenta que el movimiento de un monómero afecta a tres ángulos de enlace: el ángulo en el monómero y en sus dos vecinos. Los movimientos intentados se aceptan con probabilidad \(P={{{{\rm{min}}}}}}(1,\exp (-{{\Delta }}E/{k}_{B}T) )\), donde ΔE/kBT es el cambio de energía debido al movimiento. Los movimientos permitidos del monómero (movimientos que obedecen a las condiciones de exclusión de volumen, longitud del enlace, longitud del puente) se intentan a una velocidad p. Establecimos el parámetro de rigidez k = 14 para dar una longitud de persistencia (calculada según el ángulo entre enlaces consecutivos68) de 120 pb (Figura complementaria 1a) de acuerdo con las mediciones experimentales38.

Al igual que otras bacterias, el ADN cromosómico en C. crescentus constituye una fracción de volumen de ~1 a 2%. Obtenemos esta relación de volumen en las simulaciones configurando adecuadamente el tamaño de la red. En el BFM, el volumen ocupado por el polímero no es una cantidad fija debido al gran conjunto de vectores de enlace; el volumen excluido asociado con cada monómero puede superponerse. Sin embargo, podemos medir el volumen ocupado dilatando la imagen binaria tridimensional que describe la ocupación de cada sitio de la red usando un elemento estructurante cúbico de ancho 3 (usamos la función strel de MATLAB). Esto da precisamente el volumen excluido de todo el polímero (recordemos que cada monómero ocupa de forma única ocho puntos de la red). Usando una red cúbica de 90 × 90 × 90 y el parámetro de rigidez elegido anteriormente, encontramos una fracción de volumen excluido del 1,7% (un volumen excluido por monómero de ~22 sitios de red).

Sobre esta rígida estructura de polímero, implementamos puentes entre monómeros no vecinos. Nuestra implementación es similar a la de Bohn y Heermann69. Se permite que dos monómeros no vecinos cualesquiera que estén dentro (estrictamente menos de) una distancia espacial de 3 sitios de red formen puentes. La tasa (probabilidad) de formación de puentes depende de las posiciones de los monómeros dentro del polímero. En las Figs. 1 y 2, la velocidad se especifica, hasta un factor general, por el perfil de unión de ParB (determinado agrupando el perfil experimental ChIP-Seq con la resolución de 20 pb del polímero). La tasa de formación de puentes entre dos monómeros que están próximos es entonces igual a la tasa de formación de puentes general, kb multiplicada por el producto de la ocupación de ParB en cada sitio, BiBj. Los monómeros puenteados todavía pueden moverse en la red, pero deben mantener una longitud de puente estrictamente inferior a 3. Cada monómero sólo puede formar puentes con como máximo otro monómero.

Los puentes se rompen aleatoriamente con una vida media de 1/kub y en todo este manuscrito se utiliza un valor de 1 s. La escala de tiempo de la dinámica del monómero τ = 1/p no se conoce experimentalmente en las escalas de longitud corta simuladas aquí. En la primera parte de este artículo, sólo la relación de estas dos escalas de tiempo es relevante, de modo que podemos dejar kub fijo y variar la velocidad de movimiento p del polímero. Para el diagrama de fases presentado en la Fig. 1d variamos p de 20 a 2 × 106, para el resto del artículo tomamos los valores elegidos arbitrariamente de p = 40 para representar el régimen estructurado y p = 4 × 103 para el régimen globular. , mostrado por las líneas de puntos blancas en la Fig. 1d.

Para cualquier conjunto de parámetros dado, las simulaciones se ejecutan primero hasta que se alcanza el equilibrio según lo determinado por el volumen ocupado por el polímero que alcanza un valor constante aproximado. Usamos el volumen ocupado en lugar del habitual radio de giro al cuadrado, ya que se descubrió que el primero es una medida mucho menos ruidosa. Luego se registra la conformación del polímero. Repetimos este proceso para 1000 configuraciones iniciales aleatorias.

El radio de ParB se calcula combinando la distribución genómica de ParB en el ADN (ya sea según el perfil ChIP-seq para las simulaciones de polímeros desacoplados o la posición simulada de los dímeros de ParB en las simulaciones acopladas) con las conformaciones simuladas del polímero de ADN para obtener una distribución espacial de ParB unido al ADN. Tomamos un promedio de las 1000 conformaciones, alineándolas según sus centroides, para obtener una densidad 3D. Luego determinamos el radio dentro del cual se encuentran el 95% de los dímeros de ParB. Convertimos este valor de unidades de red a nanómetros de la siguiente manera. En nuestras simulaciones de polímeros (rígidos), la longitud del enlace entre monómeros varía pero tiene un valor promedio de 3,0 unidades de red. Dado que cada enlace/monómero corresponde a 20 pb y la longitud de un par de bases es de 0,33 nm70, una unidad reticular corresponde a 2,2 nm.

Modelamos la carga, el deslizamiento (difusión) y la desunión de los dímeros ParB del ADN utilizando el mismo enfoque que en nuestro trabajo reciente sobre M. xanthus13. El ADN se modela como una red unidimensional en la que cada sitio de la red corresponde a 20 pb. El modelo es de ocupación individual: la carga y el deslizamiento solo pueden ocurrir si el sitio de la red objetivo está libre. Los dímeros ParB pueden cargarse en algún número de sitios especiales de la red, correspondientes a los sitios parS. Para las simulaciones de deslizamiento en C. crescentus, la tasa de carga relativa en cada sitio parS está determinada por \(\frac{1}{{K}_{d}}\) donde Kd es la constante de disociación medida12. La tasa de carga en cada sitio se determina multiplicando por un factor general kon. Los dímeros se difunden hacia el sitio desocupado de la red vecina con una velocidad d = D/h2, donde D es el coeficiente de difusión efectivo y h es el espaciamiento de la red. La desvinculación se produce aleatoriamente con rate koff. El número total de dímeros se fija en 360 según lo estimado para C. crescentus35. Se supone que todos los dímeros libres están en el citoplasma, que consideramos que está bien mezclado. Esta es una suposición simplificadora y no hacemos ninguna afirmación con respecto al mecanismo de orientación de ParB a los sitios parS. Evidentemente, debe ser lo suficientemente rápido en relación con el tiempo de rotación medido de 64 s del complejo de partición. Esto podría verse facilitado por la alta concentración local de dímeros unidos cerca de los sitios parS (en cuyo caso el citosol en realidad no estaría bien mezclado). Desde el punto de vista del modelo, esto sólo significaría que una tasa de carga más baja kon sería suficiente para cargar la misma cantidad de ParB.

Para cada conjunto de parámetros, primero se ejecuta la simulación hasta que se alcanza el estado estacionario y luego se registra la distribución de ParB a intervalos de tiempo regulares, suficientemente separados para ser muestras independientes de la distribución del estado estacionario.

Proporcionamos una descripción analítica del deslizamiento para el caso simplificado de un solo sitio parS. Considere los dímeros de ParB que se difunden en una red infinita de ocupación única (espaciado de red h). Los dímeros pueden moverse a cualquier sitio vecino desocupado a una velocidad d. Los dímeros se cargan en la red en un sitio i = 0 con velocidad \({\bar{k}}_{{{{{{{\rm{on}}}}}}}}}\) y se desvinculan con velocidad koff. La probabilidad de que haya n dímeros ParB en el iésimo sitio la denotamos como Pn(i, t) (n = 0, 1 debido a ocupación única). La ecuación maestra química que corresponde a este sistema de reacciones es

Usando P0(i, t) + P1(i, t) = 1, podemos reescribir esto en términos del número esperado de dímeros en cada sitio, \({E}_{i}(t)=\mathop{\ suma }\nolimits_{n=0}^{1}n{P}_{n}(i,t)={P}_{1}(i,t)\), como

Se obtiene una ecuación similar para Ei(t) para un modelo de ocupación múltiple pero con un prefactor diferente en el término delta de Kronecker71, es decir, la distribución en estado estacionario de ambos modelos tiene la misma forma. Esto se describe más fácilmente en el límite continuo (h → 0, d → ∞, \({\bar{k}}_{{{{{{{{\rm{on}}}}}}}}}\ a \infty\) manteniendo D = dh2 y \({k}_{{{{{{{{\rm{on}}}}}}}}={\bar{k}}_{{{{ {{{{\rm{on}}}}}}}}}h\) fijo) en el que obtenemos

La solución en estado estacionario de esta ecuación es

donde \(\lambda=\sqrt{D/{k}_{{{{{{{\rm{off}}}}}}}}}}\) es la escala de longitud difusiva asociada.

Antes de adaptarnos al perfil experimental de ChIP-seq, primero agrupamos el perfil con una resolución de 20 pb para que coincida con las simulaciones. Luego ajustamos el lado derecho del pico más a la derecha del perfil experimental (Fig. 3d) a una exponencial y = aex/λ como se esperaba del análisis anterior. Usamos la función de ajuste de MATLAB para ajustar el parámetro de escala de longitud λ, para el cual encontramos λ = 710 pb. El análisis anterior muestra que \(\lambda=\sqrt{\frac{D}{{k}_{{{{{{{\rm{off}}}}}}}}}}}\) y nosotros confirme esto numéricamente. Por lo tanto, podemos usar la estimación de koff obtenida del experimento FRAP para obtener D = 5600 bp2s−1 = 6,1 × 10−4 μm2s−1. Tenga en cuenta que este valor de D no tiene en cuenta ningún obstáculo más allá del efecto de deslizar los dímeros ParB entre sí. El parámetro restante del modelo deslizante es el factor general de las tasas de carga, kon. Esto se determina encontrando el mejor ajuste del modelo estocástico a todo el perfil de unión de ParB según lo determinado por el error cuadrático medio entre el perfil ChIP-Seq y el perfil de estado estacionario obtenido de las simulaciones (Figura complementaria 3c). Ambos perfiles se normalizan a la misma área bajo la curva antes de calcular el error cuadrático medio.

Para las simulaciones de barricadas utilizamos el mismo marco pero con un solo sitio parS y elegimos una tasa de carga alta kon = 100 de modo que este sitio esté ocupado la mayor parte del tiempo. Usamos los valores de D y koff como se indicó anteriormente. Un obstáculo se implementa como otra partícula que puede unirse y desvincularse hacia y desde un sitio específico a 25 sitios de red (500 pb) de distancia del sitio parS.

Para explorar el efecto del obstáculo podemos (1) fijar la tasa de desvinculación kR,off de manera que el tiempo medio de residencia (\(\tau=\log (2)/{k}_{{{{{{{{ \rm{R,off}}}}}}}}}\)) de la barricada permanece constante y luego variar la tasa vinculante kR,on para variar la ocupación de la barricada, o (2) fijar la ocupación (kR, on/(kR,on + kR,off)) del control de carretera y varía tanto kR,on como kR,off por el mismo factor.

En las simulaciones acopladas, la probabilidad de formación de puentes depende de las ubicaciones reales de los dímeros deslizantes de ParB en el polímero. Los dímeros ParB puenteados no se difunden a lo largo del ADN debido a las limitaciones topológicas de estar unidos a regiones distales del ADN. Por lo tanto, los dímeros puenteados actúan como obstáculos para los dímeros no puenteados, impidiéndoles pasar. Mantenemos el polímero con la misma longitud que antes (500 monómeros), sin embargo, agregamos 250 sitios de red adicionales a cada extremo sobre los cuales también se permite el deslizamiento. Esto proporciona una longitud suficiente para tener en cuenta los raros dímeros de ParB de difusión lejana antes de que se disocian.

Los parámetros se toman de los encontrados en las simulaciones anteriores: p es 40 o 4 ×103 s−1, para los regímenes estructurado y globular respectivamente, y la tasa de desvinculación de ParB \({k}_{ub}=\frac{{ {{{{\rm{log}}}}}}(2)}{64}{s}^{-1}\), y la tasa de carga general de ParB kon = 200 ⋅ koffs−1. El coeficiente de difusión del modelo deslizante no se puede utilizar debido al efecto de bloqueo de los puentes. Por lo tanto, se elige junto con la tasa de puenteo kb para que se ajuste mejor al perfil de ChIP-seq y, al mismo tiempo, da como resultado el nivel de condensación observado (radio ParB de 78 nm). Aumentar el coeficiente de difusión más allá de cierto punto no tiene ningún efecto debido a que los dímeros deslizantes de ParB alcanzan el estado estacionario entre los puentes.

La simulación se ejecuta hasta que se alcanza el estado estacionario, según lo determinado por el volumen ocupado por el polímero, antes de tomar una instantánea. Para cada conjunto de parámetros probado se ejecutan 1000 simulaciones, cada una con una conformación inicial diferente.

El modelo más cercano al trabajo actual es el modelo de extensión y puente20. Este modelo de equilibrio mostró cómo ParB podría compactar la región centromérica mediante una combinación de puentes e interacciones con el vecino más cercano. En ese momento no se sabía que ParB es una abrazadera de ADN y, por lo tanto, el modelo se basó en la unión de ParB a ADN no específico. Si bien el modelo nominalmente tenía en cuenta la rigidez del ADN, el modelo de polímero utilizado permitía sólo ángulos de enlace de 0∘ o 90∘ y, por lo tanto, era poco probable que capturara completamente la interacción entre los puentes ParB y la rigidez que observamos en nuestro modelo. El modelo de nucleación y enjaulamiento11,21 no se puede comparar directamente con el nuestro ya que no modela ParB explícitamente sino que lo trata como una distribución espacial fija centrada en el sitio parS. Se propuso que esto era el resultado del autoensamblaje de ParB debido a interacciones de ADN propias y no específicas junto con la nucleación en el sitio parS (posteriormente descrita como separación de fases líquido-líquido43). A diferencia de nuestro modelo, ParB no tuvo ningún efecto sobre el ADN (no se consideraron los puentes), que se modeló como un polímero gaussiano. Si bien este modelo requería una longitud de persistencia no físicamente corta para explicar el perfil de unión de ChIP-Seq, esto se resolvió posteriormente al incluir el efecto del superenrollamiento del ADN22.

La cepa MT174 de C. crescentus (parB::egfp-parB)72 se cultivó en medio mínimo M2G73 a 28 ∘C y 220 rpm durante 36 h hasta una DO600 de ~0,6. Las células se colocaron en almohadillas hechas de agarosa al 1% (p/v) en medio M2G. Las imágenes se tomaron con un microscopio Zeiss Axio Imager.Z1 equipado con un objetivo Zeiss Plan Apochroma 100x/1.46 Oil DIC y una cámara pco.edge 4.2 sCMOS (PCO). Se utilizaron una fuente de luz de haluro metálico X-Cite 120PC (EXFO, Canadá) y un cubo de filtro ET-EGFP (Chroma, EE. UU.) para la detección de fluorescencia. El análisis FRAP se realizó blanqueando focos únicos de EGFP-ParB utilizando un láser de estado sólido de 488 nm y un módulo FRAP multipunto 2D-VisiFRAP (Visitron Systems, Alemania), con pulsos de 2 ms/píxel al 20% de potencia del láser. Después de la adquisición de una imagen previa al blanqueo y la aplicación de un pulso láser, se registraron 16 imágenes a intervalos de 20 s con VisiView 4.0.0.14 (Visitron Systems). Para cada punto temporal, se determinaron las intensidades de fluorescencia promedio de regiones de igual tamaño que contienen el foco blanqueado, el foco no blanqueado, el fondo celular y una región de referencia de la almohadilla de agarosa, utilizando Fiji 1.4974. Después de la corrección de fondo, la normalización y el promedio de las intensidades de enfoque, se calculó el tiempo medio de recuperación ajustando los datos como se describe a continuación.

Para calcular el tiempo de residencia de los dímeros ParB a partir del fotoblanqueo, realizamos una manipulación simple de los datos. Siguiendo el cálculo estándar utilizado en 43, los experimentos FRAP pueden describirse mediante un modelo cinético simple para las proteínas ParB en el complejo de partición y la ParB en el resto del citoplasma. Considerando B1(t) y B2(t) como el número promedio de proteínas ParB en cada complejo de partición después del fotoblanqueo, Btot el número total de dímeros de ParB y kin y kout la velocidad de entrada y salida de los complejos de partición respectivamente, el sistema puede escribirse como:

Para ajustarnos a los datos más fácilmente consideramos la suma y la diferencia, B± = B1(t) ± B2(t):

La solución general de estas ecuaciones viene dada por:

Un ajuste exponencial simple de nuestros datos a la curva de diferencia (Figura complementaria 3b) encuentra kout = 0,011 s−1, o un medio tiempo en el foco de 64 s y B−(0) = 0,91. Luego, ajustando la suma, tomando B∞ igual a 0,62, encontramos B+(0) = 1,06 y kin = 0,0035 s−1. Usando estos valores ajustados podemos trazar B1(t) y B2(t) en la Fig. 3c usando la transformación simple \({S}_{1}=\frac{1}{2}({S}_{+} +{S}_{-})\) y \({S}_{2}=\frac{1}{2}({S}_{+}-{S}_{-})\).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados a partir del modelo de polímero se pueden encontrar en https://gitlab.gwdg.de/murray-group/kBFM/-/tree/bridging_prob y los conjuntos de datos generados a partir del modelo deslizante y puente acoplado en https:// gitlab.gwdg.de/murray-group/kBFM/-/tree/acoplado. El número de acceso para los datos de ChIP-seq es GSE10023312. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código para la simulación de polímeros está disponible en https://gitlab.gwdg.de/murray-group/kBFM/-/tree/bridging_prob. El código para la simulación de deslizamiento está disponible en https://gitlab.gwdg.de/murray-group/Caulobacter_ParABS/-/tree/Caulo_20bp. El código para el polímero acoplado y la simulación de deslizamiento está disponible en https://gitlab.gwdg.de/murray-group/kBFM/-/tree/acoplado.

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Agradecemos a Jean–Charles Walter (Montpellier) por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la Sociedad Max Planck.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto Max Planck de Microbiología Terrestre y Centro de Microbiología Sintética, 35043, Marburg, Alemania

Lara Connolley, Martin Thanbichler y Seán M. Murray

Departamento de Biología, Universidad de Marburg, 35043, Marburg, Alemania

Lucas Schnabel y Martin Thanbichler

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SMM concibió el proyecto. SMM y LC realizaron el modelado y análisis computacional. MT y LS realizaron los experimentos FRAP. SMM y LC escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Seán M. Murray.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Connolley, L., Schnabel, L., Thanbichler, M. et al. La estructura compleja de partición puede surgir del deslizamiento y la formación de puentes de dímeros ParB. Nat Comuna 14, 4567 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40320-y

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Recibido: 21 de diciembre de 2022

Aceptado: 20 de julio de 2023

Publicado: 29 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40320-y

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